微波提取芦笋茶黄酮工艺的研究.pdf

黄酮类化合物是存在于植物中的一类低分子次生代谢产物。近年来的研究表明，黄酮类化合物具有广泛的生理功能，如清除自由基、抗癌、抗氧化、抗病毒等生理活性和药理作用，显示了黄酮化合物在医药及食品领域具有广阔的应用空间。

芦笋是一种营养和药用价值均极高的蔬菜。分析表明，芦笋中除含多种营养素外，还含有抗氧化剂、细胞免疫激活剂以及细胞生长调节剂等物质，这些成分包括皂苷、固醇、黄酮苷、异黄酮、含硫氨基酸、维生素类、糖类免疫激活剂以及锰、锌、铜、铁等微量矿物质圜。芦笋虽好，但新鲜芦笋不宜保存，存放3d一5d其新鲜度大幅度降低，组织逐渐变硬并失去大量营养素。采用现代技术将新鲜芦笋制成芦笋茶，不仅保留了原芦笋中的营养成分，而且可以长期存放。目前，对芦笋茶中黄酮类化合物的研究还较少。微波是一种高频电磁波，具有很强的热效应。微波用于天然成分的提取，具有选择性强、操作时间短、溶剂耗量小、目标组分得率高且能极大限度地保留分离组分的天然活性等优点。本实验以芦笋茶为原料，探讨用微波法从芦笋茶中提取黄酮的最佳工艺，并对提取物的抗氧化性进行研究，为芦笋茶的开发利用提供了基础依据。

1材料与方法

1.1主要原辅材料

芦笋茶：由国家农产品保鲜工程中心(天津)提供。芦丁，亚硝酸钠，硝酸铝，无水乙醇，硫酸亚铁，三氯醋酸，硫代巴比妥酸，二苯代苦味肼基自由基(DPPH)，以上试剂均为分析纯，购于天津市化学试剂公司。

1.2主要仪器与设备

FW80微型高速万能试样粉碎机：上海长乐电器厂;VIS一7220型分光光度计：北京瑞利分析仪器公司;FA1104N型电子分析天平：上海精密科学仪器有限公司;LD5—2A型离心机：北京医用离心机厂;格兰仕微波炉：顺德格兰仕电器实业有限公司;HZS—H型水浴振荡器：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司;79—1型磁力搅拌机：上虞市宏兴机械仪器实业公司。

1-3实验方法

1.3.1提取工艺流程

芦笋茶一预处理一乙醇浸泡一微波处理一离心分离一取上清液一测定黄酮含量操作要点：芦笋茶过40目筛，得到芦笋茶粉末，备用。取芦笋茶粉用一定浓度的乙醇浸泡后，再在微波条件下进行提取，离心后取上清液，测定其中黄酮的含量，并计算黄酮得率。

1.3-2单因素实验设计

基本实验条件：微波功率：中档(700W);加热时间：45s;料液比：1：20;乙醇浓度：70%;室温。

1.3.2.1微波时间对黄酮得率的影响

按提取基本条件，分别考察微波15s、30s.45s和60s时对黄酮提取得率的影响。

1.3.2.2料液比对黄酮得率的影响

按提取基本条件，分别考察料液比1：15、1：20、1：25和1：30时对黄酮提取得率的影响。

1.3.2.3乙醇浓度对黄酮得率的影响按提取基本条件，分别考察乙醇浓度为30%、50%、70%和90%时对黄酮提取得率的影响。

1.3.3正交实验设计

利用正交实验进一步考察时间、料液比、乙醇浓度三个因素对提取效果的相互影响。实验选用L9(34)设计研究提取条件对提取效果影响的主要因素，并确定最佳工艺。实验设计如表1。

表1正交实验因素及水平表

1.4指标测定

1.4.1芦丁标准曲线的绘制

精确吸取0.1mg/mL芦丁标准溶液0.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0mL于6个25mL比色管中，用30%的乙醇补至10mL，加人1mL5%NaNO2，摇匀，放置6min后，加人1mL10%A1(NO3)3，再放置6min，加人10mL1moL/LNaOH，摇匀显色，定容，静置15min，以零管为空白，在510nm处测定系列吸光度圄。用最小二乘法做线性回归，求得芦丁浓度(Y)与吸光度(A)的关系曲线。

1.4.2黄酮含量及黄酮得率的计算

黄酮含量(%)=(Yx25x25x25/Mx5x2xl000xl00%(1)

式中：Y ——黄酮浓度(mg/mL)

25——样液稀释后的体积(mL)

M——原料质量(g)

5.2——吸取的样液量(mL)

式(2)中芦笋茶中的总黄酮含量的测定：芦笋茶用70%乙醇浸润后，于80℃水浴浸提6h，滤渣采用相同方法重复提取3次，将3次的提取液合并后测得的黄酮含量作为芦笋茶中的总黄酮含量。按此方法测得的总黄酮含量为3.74%。

1.4.3芦笋茶中黄酮的抗氧化功能研究

1.4.3.1清除自由基的测定一DPPH法

DPPH是一种稳定的自由基，其乙醇溶液呈紫色，在517nm处有最大吸收。当在DPPH溶液中加入自由基清除剂后，溶液颜色变浅，517nm处的吸收光度变小，且吸光度变小的程度与自由基被清除的程度呈线性关系，可用于检测自由基被清除的程度，从而评价物质的抗氧化能力。其能力用抑制率来表示，抑制率越大，抗氧化能力越强。配制不同黄酮浓度的样品液(见表2)，并按下面的测量方法测定抑制率。

表2黄酮样品液制备

精确吸取样品溶液2.0mL于试管中，加人2*10―4mol的DPPH溶液2.0mL，摇匀，放置30min，以80%乙醇为空白，分别测定517nm处的吸光度Ai。同时，测定样品溶液2.0mL与2.0mL80%乙醇混合液517nm处的吸光度。再测定DPPH溶液2.0mL与乙醇2.0mL混合液517nm处的吸光度Ac。每组平行测定3次，取平均值后根据以下公式计算样品抑制率：

抑制率=[1一(Ai—Aj)/Ac]×100%(3)

式中Ai—样品液与DPPH溶液混合液的吸光度;

Aj——样品液与乙醇混合液的吸光度;

Ac——DPPH溶液与乙醇混合液的吸光度。

1.4.3.2抗脂质过氧化活性的测定

黄酮类化合物是一类性能优良的天然食品抗氧化剂，本实验采用依赖鸡卵黄脂蛋白的脂质过氧化模型，测定样品抗脂质氧化能力。抑制率越大，则样品抗脂质过氧化能力越强。

操作步骤：新鲜卵黄用等体积的0.1mol/LpH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)按1：1配成悬液，并按1：25倍稀释，磁力搅拌30min。在试管中加入卵黄悬液0.4mL;并分别加入样品0.2mE(对照管PBS);再加入25mmo1的硫酸亚铁0.4mL;用0.1mol/LpH7.4PBS补至4.0mL，置于37℃水浴振荡50min。取出后加入20%三氯醋酸1mL，静置10min后，3000r/min离心15min，取上清液4mL加入0.8%硫代巴比妥酸2mL，塞紧管口100℃水浴15min，空白管以PBS取代上清液，其余相同。532nm测光吸收，平行测定3次，取平均值并根据公式

(4)计算样品抑制率：

抑制率%=(对照液吸光度一样品液吸光度)/对照液吸光度×100%(4)

2结果与讨论

2.1标准曲线(见图1)

用最小二乘法作线性回归得芦丁浓度与吸光度关系曲线的回归方程式：

Y=O.09712A+4.482×10R2=0.9998(5)

其中：Y为芦丁浓度(mg/mL);

A为吸光度值。

图1芦丁样品标准曲线

2.2微波提取的单因素实验结果

2.2.1微波时间对黄酮含量的影响

微波提取时间对芦笋茶黄酮含量的影响见图2。

图2微波时间与黄酮得率的关系

图2结果表明，当提取时间为15S时，芦笋茶中的黄酮不能充分转移到提取液中，黄酮含量比较低;以后随着提取时间的延长，黄酮含量增加，在45S时达到峰值，黄酮含量最高;此后，时间继续增加，黄酮提取率反而降低，这可能是微波过程中产生的热能会造成黄酮组分损失的缘故。

2.2.2料液比对黄酮含量的影响

图3显示的是料液比对提取芦笋茶黄酮的影响。图3结果表明，随着料液比的增加，黄酮含量也相应增加，但当料液比达到1：25后，黄酮含量增加不明显，这说明黄酮已经充分转移到提取液中，增加乙醇体积，黄酮含量将不再明显增加。而且料液比过大，将不利于后续的浓缩工艺。所以，微波时的料液比选择在1：25较好。

图3料液比与黄酮得率的关系

2.2.3乙醇浓度对黄酮含量的影响

乙醇浓度对黄酮含量的影响见图4。图4结果表明，随着乙醇浓度的增加，黄酮得率增加，在乙醇浓度为70%时达到最大值;继续增加乙醇浓度，黄酮的提取效果趋于平缓，考虑经济因素，乙醇浓度可以选择在70%-80%。

图4乙醇浓度与黄酮得率的关系

2.3正交实验结果与讨论

表3正交实验结果

正交实验结果见表3，表3表明，各种因素对提取效果影响的主次顺序为：乙醇浓度>时间>料液比。最佳工艺条件为：时间45S，料液比1：25，乙醇浓度80%，在此工艺条件下所得黄酮含量为3.29%，黄酮得率为88.0%。

2.4清除自由基活性的结果(见表4及图5)

表4不同浓度样品液的吸光度值

图5黄酮提取物浓度与自由基抑制率的关系

由表4、图5结果知，样品液对自由基有较好的清除作用，随着样品液浓度增加，清除作用加强，但当浓度增大到一定值时，清除率不再随浓度的增加而改变。本实验中样品液浓度在0.66mg/mL时抑制率达到最大值，此浓度下的抑制率为91.2%。为了对芦笋茶提取液的抗氧化能力进行评价，实验将样品液与TBHQ的抗氧化能力进行了比较。配制浓度为0.66m咖L的TBHQ溶液，相同条件下测得其抑制率为92.3%。比较可知，在相同浓度下芦笋茶提取液清除自由基的能力与TBHQ相当，具有很强的抗氧化能力。目前，对芦笋茶的抗氧化活性方面的研究尚未见报道，本实验的研究结果为芦笋茶的进一步开发利用提供了实验证据。

2.5抗脂质过氧化的结果(见表5)

表5样品的抗脂质氧化能力

表5结果表明，样品对脂质过氧化物有一定的抑制作用，在浓度为1.32mg/mL时，抑制率为14.4%。将样品液的抑制率与Vc的作比较，在相同抑制率下，Vc的浓度为0.1mg/mL，即13g芦笋茶的抗脂质氧化能力相当于1gVc所具有的抗脂质氧化能力。由此可见，芦笋茶提取液具有较好的抗脂质氧化能力。

3结论

由单因素实验和正交实验结果得到芦笋茶中黄酮的最佳微波提取条件为：乙醇浓度8O%、微波时间45S、料液比1：25。在此条件下得到的提取液中的黄酮含量为3.29%，黄酮得率为88.0%。对芦笋茶提取液中黄酮的抗氧化性研究表明：提取液对自由基有很强的清除作用，清除效果随提取液浓度的不同而变化，在浓度为0.66arg/mE时的清除效果最好，抑制率为91.2%。此外，芦笋茶提取液有一定的抗脂质氧化能力，在浓度为1.32mg/mL时，抑制率为14.4%。