微波消解分子荧光法测定茶叶中硒的含量

茶树是一种集硒能力较强的植物，它能将无机态硒转化为有机态硒而易于人体的吸收。因此，茶叶是理想的补硒饮品，而对茶叶中硒含量的测定是补硒研究最基本的任务。硒易于挥发而损失，常规的湿法消解由于温度不易控制及加热时间较长而易造成硒损失与样品和环境污染。自从1975年文献中报道微波湿法消解样品以来，微波溶样技术得到了较大的发展。微波消化样品的方法具有快速、准确、省试剂、省费用、污染少、待测元素不易损失等特点。笔者采用微波消解分子荧光法测定茶叶中的硒含量，主要探讨微波法消解茶叶样品时，微波消解试剂、消解功率、时间等因素对硒测定的影响，以优化微波法消解条件。鉴于消解样品茶叶的特殊性，结合茶叶微波消解条件，对基于硒（IV）与DAN（2，3-二氨基萘）生成具有强荧光特性的4，5-苯并苤硒脑的分子荧光光度法测定硒含量相关的DAN用量、萃取剂用量等测定条件进行了优化。

1材料与方法

1.1材料茶叶样品为陕西省紫阳县紫健牌紫阳绿茶（陕西省紫阳县紫健富硒茶厂生产）。硒粉（光谱纯，天津科密欧科技有限公司生产）；2，3一二氨基萘（AJohsonMattheyCompa-ny，NewJersey.USA）。EDTA、盐酸羟胺、浓硝酸、高氯酸、浓盐酸、环己烷、甲酚红指示剂及其他试剂至少为分析纯，未经纯化直接使用，试验用水均为二次蒸馏水。主要仪器有LWMC一205可调功率微波化学反应器（南京陵江科技开发有限公司），RF一5301型荧光光度计（日本岛津）。

1.2方法

1.2.1储备液的配制。100.0ug／ml硒标准储备液，0.1％2，3二氨基萘（DAN）溶液，EDTA一盐酸羟胺混合液：参照GB／T5009.93-2003中华人民共和国国家标准--食品中硒的测定方法》中“8.1、8.2、8.5”配制。1.0g／ml硒标准使用液：移取一定量硒标准储备液用0.1mol／LHC1稀释，于冰箱内保存。

1.2.2标准曲线的绘制。

分别准确移取1.0g／ml硒标准液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0ml于250ml锥形瓶中，各加20.0mlEDTA一盐酸羟胺混合溶液，加入5.0mlDAN溶液，用盐酸一氨水缓冲溶液调节pH值1.5～2.0，溶液呈淡红橙色，在沸水浴中加热反应5min，取出立即冷却，然后分别用6.0ml环己烷萃取，振摇5min，将全部溶液移入分液漏斗，静置分层后弃去水层，环己烷萃取层从漏斗上口转入带盖的比色管中待用。萃取液用1cm比色皿，在RF一5301型荧光光度计上进行荧光强度的测定。荧光光度计选择高灵敏度，狭缝宽度3BITI，激发波长377nm，发射波长519nlFl，由测得的荧光值与se浓度绘制标准工作曲线。

1.2.3样品消解及分析。

取80.0g茶叶样品于坩埚中，在60℃下烘2h，将烘好的样品粉碎后用100目分样筛分样。准确称取0.5g处理好的样品于微波化学反应器的容器中，先用5.0ml5.0％硫酸润湿，再加入浓硝酸一高氯酸（4：1）混合酸10.0rnJ，放入微波反应器中消解，微波功率0.20kW时消解30min，当伴有白烟，且溶液淡黄色、无残渣时取出，然后沸水浴加热15min，除去残余的氮氧化物，取下冷却，加入10.0ml盐酸（1：9）混匀，继续加热至溶液变为清亮无色并伴有白烟出现，此时se6+还原为se4+。将此消解液同标准曲线绘制方法和条件测定其荧光强度，由标准曲线上查得硒浓度值，计算其相应含量。

2结果与分析

2.1微波消解试剂的选择硒的测定中，样品消解试剂一般选择硝酸一高氯酸混酸体系，由于微波消解不同于湿法消解，有必要对混酸比例进行选择。取0.5g筛分好的茶叶样品5份于消解容器中，分别用5.0ml5.0％硫酸润湿，向每份样品中加入HNO：HCIO体积比为2：1、3：1、4：1、5：1、6：1的混合酸共10.0Inl，在微波功率为0.10kW时消解样品，以溶液无残渣、淡黄色作为消化终点，然后按“1.2.3”步骤操作，用“1.2.2”方法测定试液的荧光强度，测定结果如表1所示。由表1可见，混酸比例HNO：HCIO在5：1-6：l时测定结果偏低，说明消解不完全；而在2：1-4：1时，测定结果无显着性差异。本着HCIO少用的原则，选用混酸比例HNO：HCIO为4：1。

表1消解试剂对测定结果的影响

2.2微波消解功率、时间的确定取0.5g筛分好的茶叶样品5份，分别用5.0ml5.O％硫酸润湿，向每份样品中加入4：1的HNO：HCIO混酸10.0ml，将每个样品分别在微波功率0.1O、O.15、0.20、0.25、0.30kW时消解，以溶液无残渣、淡黄色作为消化终点，观察记录达到终点所需的时间，然后同“2.1”的方法，测定各试液的荧光强度（表2）。试验发现，随着功率增大，消解时间减短，但当功率达0.25kW时，试液荧光强度明显减小。可能是因为微波功率过高时，因温度较高造成样品中硒的挥发损失。综合考虑功率、时间因素，该试验选择0.20kW消解30min。

表2微波条件对测定结果的影响

2.3络合剂DAN溶液用量的优化鉴于消解样品茶叶的特殊性，基于国标测定方法，笔者对DAN溶液（0.1％）的加入量进行了优化。方法是：于7个250rrd锥形瓶中各加入1.0~g／ml硒标准使用液1.0rnl，再加入20.0mlEDTA一盐酸羟胺混合液，用盐酸和氨水缓冲溶液调节pH值1.5～2.0，分别加入1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0ml0.1％DAN溶液，沸水浴中加热5min，用10.0rnl环己烷萃取后，测定各萃取液的荧光强度，试验结果见图1。由图1可见，当DAN加入量达到4.0ml时，荧光强度趋于稳定，确定5.0rnl为DAN最佳用量。

图1DAN对荧光强度的影响

2.4环己烷萃取剂用量的优化试验中发现，环己烷用量不足，萃取不完全，荧光值较小；环己烷用量过大，被萃取物浓度降低，亦导致荧光值下降。因此，笔者对萃取剂甩量进行了优化试验。取1.0ml硒标准使用液1.0ml于6个250ml锥形瓶中，加入20.0mlEDTA一盐酸羟胺混合溶液，缓冲溶液调节pH值1.5～2.0，加入0.1％DAN溶液5.0ml，沸水浴中加热5min，分别用2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0ml环己烷萃取反应物，测定各溶液的荧光强度。由图2所示的试验结果，确定环己烷的最佳用量为6.0rnl。

图2环己烷用量对荧光强度的影响

2.5共存离子的影响研究表明，铜、铁、钼等重金属离子及大量氧化物对测定硒有干扰，可用EDTA.盐酸羟胺消除。由于茶叶中的有关干扰离子含量和种类具有差异性，为此，

针对紫阳富硒茶，选择Cu2+、Hg2+、zn2+、Fe3+、Bi3+、Cd2+等离子，按“1.2.2”的试验方法进行干扰试验。结果表明，测定1.0ug硒，加入20.0ml0.2％EDTA一盐酸羟胺混合溶液，zn2+、Fe3+、Bi3+、Cd2+在300倍时不干扰测定，Cu2+、Hg2+对硒的测定有一定干扰，Cu2+的允许量为200倍，Hg2+的允许量为150倍。

2.6标准曲线和相对标准偏差按“1.2.2”标准曲线的绘制方法，以1.0Ixg／ml硒标准溶液绘制标准曲线。由图3可见，硒含量在1.0-7.0ug时线性良好，回归方程y=91.761x，相关系数R=0.9909。对1.0ug／ml硒标样进行了6次平行试验，其标准偏差2.755，RSD值为2.5％。

2.7样品中硒含量的测定及加标回收率试验用“1.2.3”的试验方法微波消解茶叶样品，测定紫阳富硒茶样品中的硒含量，同时做加标回收率试验，并以湿法消解（GB／T5009.93-2003）作对照试验，测定结果见表3。两种消解方法测定样品结果的相对误差为4.21％。

表3样品分析结果3结论

（1）采用微波化学反应器消解茶叶样品的消解条件：0.5g样品加5.0InI5.0％硫酸润湿，加入HNO：HCIO（4：1）10.0ml，在0.20kW时消解30min。经与湿法消解对照。样品测定结果可靠，回收率高。该方法用于茶叶中硒的消化，省时、省力、污染小。

（2）应用分子荧光光度法测定紫阳富硒茶中微量硒含量，并对相关影响因素进行了优化。确定最佳测定条件为：pH值1.5～2.0，EDTA一盐酸羟胺混合液用量20.0rnl，0.1％DAN加入量5.0rI1l，沸水浴加热5min，6.0ml环己烷萃取，于激发波长377nm、发射波长519Nm测定荧光强度，效果较好。此外，该测定方法还可用于食品及其他产品中硒含量的测定。