山茶科植物组织培养研究进展

《中国植物志》第四十九卷第三分册记载，山茶科植物约有36属、700种，我国有15属、480余种。广泛分布于热带与亚热带地区，是华南地区常绿阔叶林的建群种，其中不乏高价值的经济树种。如原产我国的茶树(Camelliasinensis)，其嫩叶可制茶叶;油茶(C.oleifera)富含油脂，可榨茶油，供食用和工业用;山茶(C.japonica)和茶梅(C.sasanqua)花大而艳丽，是世界著名的木本花卉植物。山茶科还有许多珍稀濒危植物，如金花茶(C.nitidissima)是我国～级保护植物，有“植物大熊猫”之称。山茶科中有很多植物为国家级珍稀植物，如猪血木(Euryodendronexcelsum)、圆籽荷(Apterospermaobla—ta)和杜鹃红山茶(Camelliachangii)等，其中猪血木和圆籽荷为单种属植物，已被列为国家二级保护植物。将植物组织培养技术应用于山茶科植物的快速繁殖，对保护山茶科树种的种质资源，丰富园林植物多样性，缓解国内优质木材和园林绿化植物供应紧张的状况，具有重要的意义。本文从山茶科植物组织培养外植体的选择和分化途径、基本培养基、激素及附加营养成分的使用等方面探讨组织培养技术在山茶科植物中的研究现状和实际应用中存在的问题。

1山茶科植物组织培养培养概况

山茶科野生植物大多生长在深山老林，与世隔绝且生境范围狭窄，性喜温暖湿润气候，栽培环境应适当遮阴并保持一定的湿度，避免强阳光长时间直接照晒。由于它对栽培环境、土壤、水分及管理技术的要求比较高，加上资源稀少，应用受到极大限制，也导致人们对它的研究热情不高。我国所有的山茶科15个属中，只有山茶属、大头茶属、木荷属3个属有组织培养成功的报道，这3个属中仅有茶树和油茶的组织培养技术已趋于成熟.更多的尚在起步阶段。到目前为止，组织培养已获成功的山茶科植物有茶树(C.sinensis)、油茶(C.oleifera)”、滇大头茶(Gordoniayunnanensis)、薮北茶(Yabu—kita)、木荷(Schimasuperba)和红木荷(S.walli—chii)、金花茶(Camelliachrysantha)(表1)。

2山茶科植物组织培养外植体选择和分化途径

2.1山茶科植物组织培养外植体的的选择外植体的选择是植物组织培养能否成功的关键因素之一。外植体供体植株的年龄、发育阶段、生长环境和外植体取材部位不同可导致外植体生理状态差异.从而影响组织培养的形态发生。山茶科植物组织培养采用的外植体种类较多，包括茎尖、种子、花蕾等。无论何种外植体，它们所处的发育状态与来源均影响体胚发生，如切取茶树种子无苗萌发的子叶、胚芽、胚轴与胚根切段外植体，几种外植体诱导胚性愈伤组织的能力存在差异，只有胚轴、子叶、胚芽能产生胚性愈伤组织，其中以子叶和胚轴形成的愈伤组织生长较快。

2.2山茶科植物组织培养的分化途径通常细胞组织培养获得再生植株有两条途径，一是器官发生途径;二是体细胞胚胎培养。从现有的报道来看，山茶科植物组织培养已获成功的分化途径有器官发生途径和体细胞胚、花药发生途径两种。

器官发生包括由茎尖、腋芽、原球茎、球茎、块茎、鳞茎等外植体直接分化成器官的直接发生和外植体先脱分化形成愈伤组织再分化成器官的间接发生两种。此途径中茎芽和根是在愈伤组织或外植体的不同部位分别独立形成的。在直接器官发生途径中，以芽或带芽茎段为外植体直接诱导芽的萌发获得再生植株的植物有薮北茶、滇大头茶、龙井茶、油茶。在间接器官发生途径中，以茎段或叶为外植体通过诱导愈伤组织，再诱导芽的再生的植物有滇大头茶、油茶。

体细胞胚胎培养是指双倍体或单倍体的体细胞在特定条件下，未经性细胞融合，而通过与合子胚胎发生类似的途径发育出新个体的形态发生过程¨。杜克久等将云南大叶茶(Camelliasinensisvar.as—samicaKitamura)胚性细胞系中悬浮培养物继代转入附加0.05mg/L2，4一D和0.5mg/LBA的改良MS液体培养基上暗培养28d后，诱导外植体产生黄色、松散颗粒的愈伤组织，再转入到液体分化培养基上(不附加生长调节剂，其余同诱导培养基)培养28d，获得了不同发育时期的体胚。

花药培养是把发育到一定阶段的花药接种在人工培养基上，使其发育分化成植株的过程。郭玉琼等用铁观音的花蕾及花药在含有0.5mg/L2，4一D的MS培养基上成功诱导出了愈伤组织。

3山茶科植物组织培养的基本培养基应用于山茶科植物组织培养的基本培养基主要有：MS、1/2MS、改良MS、ER、MT，以MS培养基居多。杨国伟等报道，MS比Heller、White培养基更利于茶树愈伤组织的生长，茶树愈伤组织在MS培养基上诱导率可达到90%从已有的报道来看，基本培养基中的大量元素对山茶科植物组织堵养影响很大，MS培养基大量元素减半，不仅有利于山茶科植物茎段的诱导和生长，而且有利于减少茎段的褐化，提高成活率。在实际应用中，大多数学者在诱导和增殖培养时采用全量的大量元素，而在生根培养时采用半量的大量元素。在组织培养时，由于培养物的光合作用能力较弱，所以需要在培养基中添加一些糖类。一方面，糖作为碳源，为细胞的呼吸提供底物和能源;另一方面，在培养过程中，组织不断从培养基中吸取糖，随着时间的延长，糖浓度不断降低，不能维持正常的渗透压;此外，适宜的糖浓度对器官的发生也有重要作用。山茶科植物组织培养所需的蔗糖浓度多在4%，而金花茶胚培养需要6%～8%。

4山茶科植物组织培养的激素及附加营养物植物生长调节物质是培养基中的关键物质，虽用量极小，但在组织培养中起着重要的调节作用。激素的种类和不同功能激素的配比是影响外植体能否成功启动的关键因素之一。对茶树而言，各因素对龙井茶愈伤组织诱导的作用大小依次为：2，4一D>6一BA>NAA。在山茶科植物愈伤组织或芽的诱导阶段，大部分植物使用6一苄基腺嘌呤(6一BA)，浓度为0.5—4mg/Lj。毕方铖等在油茶试验中发现，在不同的6一BA浓度中，以30mg/L的诱导效果最好，芽的诱导率为73.33%，而在6一BA和NAA组合中，以6一BA3.0mg/L+NAA1.0mg/L为最佳浓度组合，诱导率最高，达83.33%。李建安等在广宁红花油茶和小果油茶的花药培养试验中发现，两种油茶在MS+2，4一D0.6mg/L+NAA0.4mg/L和B5+2，4一D1.2mg/L+6～BA0.4mg/L培养基中，广宁红花油茶诱导率高达94.67%和91.00%，小果油茶则分别为8.00%和3.34%。椰乳、水解乳蛋白等营养物质也被用于山茶科植物的组织培养中。谭和平等通过茶树腋芽的诱导分化试验发现，水解乳蛋白的加入可明显促进芽的诱导。山茶科植物组织培养的生根培养只需单独添加生长素BA或NAA就能有效地生根。毕方铖等在}由茶的生根培养试验中发现，NAA7mg/L或BA6～7mg/L得到较好的生根效果，但获得的再生苗大多只有一条主根，须根很少。

5山茶科植物组织培养及植株再生中存在的问题

5.1山茶科植物组织培养中的褐变

山茶科植物中酚类物质含量较高，酚类的糖苷化合物是木质素、单宁和色素合成的前体。因此，当酚类化合物含量高时，木质素、单宁或色素形成就多，易导致褐变的发生，有些细胞会因褐变而死亡。较高的培养温度、培养基中较高浓度的无机盐、较高浓度的激素及木质化程度高的外植体都会促进褐变的发生。阙生全等在试验中发现，以油茶茎段作为外植体诱导愈伤组织时，随着基本培养基中无机盐离子浓度的降低，褐化现象减轻。在培养基中加入吸附剂能有效抑制褐化的发生。通过吸附剂活性炭、PVP和3种抗氧化剂(维生素C、NaSO，和柠檬酸)对褐化的影响对比发现，加入吸附剂(活性炭)的培养基效果最好，随着其浓度的升高，抗褐化效果提高。另外，接种后暗处理，可在一定程度上减轻褐化反应。

5.2山茶科植物组织培养中的污染问题能否有效控制微生物污染是组织培养能否成功的关键因素之一。在山茶科植物组织培养中污染可分为外植体、培养基和无菌操作3个方面，其中以外植体方面的污染最复杂，也最难控制。通常在春季2～3月份和秋冬季腋芽在培养基上容易萌发，且污染现象不明显;而在夏季腋芽不仅不容易萌发且容易污染。究其原因，一方面可能与外植体的季节性带菌情况有关;另一方面可能与外植体的生理状态有关。此外，外植体消毒剂的选择和消毒时间的选择也影响污染情况。在油茶组织培养中，用25%次氯酸钠消毒20min对油茶腋芽消毒效果最好，芽的萌发诱导率达85%。

6小结与展望

山茶科植物的组织培养研究中，除了油茶、茶树等少数植物相对成熟外，还有许多种植物仍处于探索阶段。大多数植物的诱导率、增殖率、生根率等都不高，离实际应用还有一定的差距;体细胞胚胎发生、细胞培养、原生质培养的研究更有待于加强。山茶科植物组织培养研究的前景十分广阔，很多山茶科植物都具有很高的经济价值和造园价值。因此。通过组培快繁技术实现山茶科植物的大规模生产，不但可以提高它们的应用价值，而且对物种资源保护和种群扩大有着重大的意义。