微波辅助提取铁观音茶多糖及其抗氧化活性研究

O引言

茶作为当今世界三大饮料之一越来越受到人们的欢迎。尤其是近年来，人们生活水平逐步提高，对茶饮料的保健功能越来越重视。研究表明，作为茶叶中活性组分之一的茶多糖（TPS），具有抗氧化、抗血栓、降血糖、增强机体免疫能力等多种活性。随着人们对多糖生物学功能的深入认识，从各种天然产物中提取的生物活性多糖的研究成为人们关注的焦点。20世纪90年代初，日本学者清水岑夫认为茶叶中治疗糖尿病的药理成分为茶叶多糖，此后有关茶叶多糖的研究报道逐年增多。在茶叶加工过程中有大量的枝叶和灰末等副产品未被利用，因此从这些粗老茶叶和茶叶生产的副产品中提取茶多糖作为保健食品的功能因子，则可变废为宝。微波辅助浸提技术是近年发展起来的一种新型物理破壁方法，与传统热水浸提方法相比，具有节能、快速、提取效率高等优点，已被广泛用于植物有效成分的提取，尤其是以极性溶剂为萃取剂的浸提过程，但目前尚未在茶多糖加工中使用。福建是一个产茶大省，尤其以铁观音茶最为出名。本文用微波辅助浸提铁观音茶多糖，采用正交实验优化微波浸提工艺条件，并对微波浸提和常规浸提产品的抗氧化活性进行比较，为今后茶多糖高效大规模的生产，提高茶叶的综合经济效益提供依据。

1材料与方法

1.1实验材料

茶叶，市售安溪铁观音茶叶。

1.2试剂与仪器

三（羟甲基）胺基甲烷，生化试剂，中国医药集团；邻苯三酚、邻二氮菲、盐酸、过氧化氢、硫酸亚铁、无水乙醇及其他试剂，如无特殊说明均为分析纯。DKZ电热恒温振荡水槽（上海实验仪器厂）；723PC可见分光光度计（上海欣茂仪器有限公司）；BS／BT电子天平（德国赛多利斯股份公司）；RE52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；SHZ-IIID微波炉（上海亚荣生化仪器厂）；TDL一5离心机（上海安亭科学仪器厂）；pH211台式酸度测定仪（北京哈纳科技有限公司）。

1.3实验方法

1）铁观音茶多糖的提取将烘干的铁观音茶叶粉碎过筛，经乙醚回流脱脂，微波处理一定时间后于60℃热水浸提两次，每次2h，抽滤，合并滤液，减压浓缩，加入5倍体积质量分数95％的乙醇沉淀，低温静置过夜，4000r／min离心，沉淀加蒸馏水溶解，再次重复乙醇沉淀的步骤2次，最后一次得到的沉淀用少量水溶解，活性炭脱色后，Sevag法脱蛋白质4次，浓缩，真空干燥，得到铁观音茶多糖。

2）粗多糖得率的计算多糖含量测定用苯酚一硫酸法。粗多糖得率的计算以1g干品中提取出来的粗多糖占原料总量的百分数表示，计算公式为：粗多糖得率／％=（O.9×多糖质量浓度×提取液体积／原料干重）×100，其中：0.9为葡萄糖的换算系数；多糖质量浓度的单位为ug·mL―1；提取液体积的单位为mL；原料干重的单位为ug。

3）茶多糖对O2―自由基的清除率0。05mol／LTifs-HCI缓冲溶液（pH=8.2）4。4mL，25oC预热20min，加人不同浓度的茶多糖溶液0.10mL，再加入25℃预热的2.50mmol／L邻苯三酚0。50mL，混匀后于25℃恒温反应4min，然后用10mol／L盐酸终止反应，于320nm处测定吸光值。清除率按下式计算：O2―清除率／％=（1一（A1一A2）／A0）×100，其中：A0一不含茶多糖溶液的吸光值；A1一含有茶多糖溶液的吸光值；A2一含茶多糖但不含邻苯三酚溶液的吸光值。

4）茶多糖对·OH自由基的清除率取0。75mmol／L邻二氮菲溶液1mL，PBS溶液2mL和蒸馏水1mL，充分混匀后，加0.75mmol／L硫酸亚铁1mL混匀，加质量分数0.01％的过氧化氢1mL，37℃下保温60min，于536nm处测其吸光值Ap，用质量分数3O％的乙醇1mL代替1mL过氧化氢，测得吸光值Ag。再用试样1mL代替1mL蒸馏水，测得吸光值As，根据：·OH清除率／％=（As一Ap）／（Ag一Ap）×100计算·OH清除率。

2结果与分析

2.1微波提取的正交实验

根据单因素实验，选取微波功率、微波时间、水浴浸提温度和料液比4个因素，各取3个水平，选用L49三的正交表，以多糖得率为实验指标，对微波处理的工艺条件进行优化，并对结果进行极差及方差分析，确定最适作用条件。正交实验的方案与结果见表1，方差分析见表2。

由表1极差分析可以看出，随着微波功率的增加，粗多糖得率呈上升趋势。微波功率增大，固定物料在单位时间内获得的能量逐步增加，加剧了茶叶纤维素细胞的破裂和组织中多糖物质分子及萃取溶剂分子的热运动，多糖类化合物的溶出与溶剂向组织内的渗入相互促进，使二者有更充分接触的机会，从而使得率增加。但是比较A2、A3水平的差值与A2、A1水平的差值发现，得率上升速度变慢，这一点在单因素实验中也得到了验证，这可能是由于当微波功率太大时，微波对细胞内物质选择性加热的性能差异减少，一些易溶于水的其他物质先被溶解，造成多糖得率降低。同时，当其他条件一定时，功率过大，提取液温度在短时间内达到上限值，微波辐射的有效作用时间会有所减短，局部温度过高会导致多糖类化合物的分解，而且微波功率过大会增加多糖提取成本。本实验中，从实验结果直接分析，微波功率应取A3水平，但考虑到A3与A2水平时多糖得率相差不大，并且从最大限度保持多糖生物活性的角度出发，选取A1水平，即微波功率375w为最佳条件。

微波时间对茶多糖得率的影响与微波功率的影响类似，即随微波处理时间的增加，茶多糖得率逐渐增大，在B水平时达最大值。微波加热可使水等极性分子在微波电磁场中快速转向及定向排列，从而产生撕裂和相互摩擦发热，正是这种剧烈运动导致植物细胞内部结构发生破坏，有助于多糖成的溶出，从而大大缩短提取时间。因此，在微波作用下富含水的部分优先破壁，而含水少的细胞则比较滞后，甚至不能被微波破壁，所以微波处理时间的延长可以增加这种极性溶剂分子间的摩擦，使其对植物细胞内部结构的破坏程度加剧。但是微波处理时间过长就会导致水分蒸发过快，从而使得细胞内多糖的提取难以进行，并且也可能导致多糖活性的降低。单因素实验也发现，当微波处理时间超过180S后，茶多糖得率有逐渐下降的趋势。因此，对铁观音茶多糖的提取，合适的微波处理时间为180S。

表1微波提取茶多糖正交实验结果

表2微波提取茶多糖正交实验方差分析

实验结果表明，随着料液比的减小，铁观音茶多糖的得率先增后降，在D2水平达最大值。多糖从茶叶细胞到溶剂是一个由浓度差推动的扩散过程，料液比较大时，固液相中有效成分的浓度差偏小，提取过程中传质速度慢，多糖溶人溶剂的量少；随着料液比的减小，两相浓度差增大，传质速度加快，扩散到溶剂里的多糖就越多。但是，从细胞中提取多糖的过程除了简单的扩散过程之外，还有受细胞膜影响的阻滞扩散过程，而阻滞扩散速度取决于细胞膜结构。增加溶剂用量虽然在一定程度上增大浓度差推动力，能促进多糖的提取，但是起决定作用的细胞膜结构并没有变化，反而可能会使细胞中其他物质溶出的机率加大，导致多糖得率降低。而且溶剂用量太多会对后面的纯化工作带来不利影响，因而，本实验选择料液比为1：30。正交实验结果表明，水浴浸提温度对得率影响不大，在C，水平时达最大值。浸提温度主要通过扩散系数来影响多糖得率，而温度与扩散系数正相关，因此要想获得较高的扩散速率，就必须设法升高提取温度，并且对于植物来源的多糖，温度升高可以增加植物细胞膜的通透性，有利于多糖的浸出。不过温度过高也会使过多的杂质溶出，不但增加分离难度，而且容易导致某些有效成分失活。对铁观音茶多糖的提取，水浴浸提温度选取6O℃较适宜，

表2表明，微波功率对多糖得率有极显着影响，微波时间和料液比对粗多糖得率均有显着影响，各因素对得率的主次影响顺序是：A（微波功率）>D（料液比）>B（微波时间）>C（水浴浸提温度），各因素的最佳水平组合为AB，c，D，即：微波功率375W，微波时间180s，水浴浸提温度6O℃，料液比1：30。采用此条件进行3次验证实验，得到粗多糖的平均得率为2。82％。

2.2茶多糖的抗氧化活性

图1和图2表明，铁观音茶多糖具有较好的清除O2ˉ·和·OH自由基效果，并且随着粗多糖浓度的增加，清除率逐渐增强，即，铁观音茶多糖对O2ˉ·和·OH的清除能力与其浓度具有明显的量效关系，并且微波处理前后，铁观音茶多糖的清除自由基效果并没有显着差异（P>0。05）。图1中，在低浓度条件下，铁观音茶多糖对邻苯三酚自氧化产生的O2ˉ·抑制作用较弱，但在高浓度条件下具有明显的抑制作用，其对O2ˉ·的半数清除质量浓度IC50约为600ug/ml，而当质量浓度为1000ug／mL时超氧阴离子清除率达到69％。图2中，茶多糖浓度较低时，剂量一效应线性关系较好，随浓度增加，·OH清除率增加较快，当浓度增加到一定程度后，对-OH的抑制率增加缓慢，剂量一效应不符合线性关系，其对·OH的半数清除质量浓度IC50约为500ug／mL，在实验浓度范围内，茶多糖对羟自由基的最大清除率为78％。

图1铁观音茶多糖对02-·的清除效

图2铁观音茶多糖对·OH的清除效

O2ˉ·是生物体内主要的活性氧自由基，也是人体内由氧衍生出来的第一个氧自由基。·OH是已知活性氧中对生物体毒性最强的一种自由基，对细胞内DNA的破坏作用最大，可造成碱基被破坏，从而产生遗传突变。近年来关于茶多糖抗氧化作用的报道越来越多，并有人据此解释了茶多糖多种生物学功能的药理学基础，这些报道都表明，茶多糖的抗氧化作用和它的结构有密切关系。研究表明，茶多糖是含有10％左右蛋白质的糖蛋白，组成单糖以半乳糖、葡萄糖和阿拉伯糖为主，还有木糖和甘露糖等，其抗氧化作用机制可能是茶多糖中的一些活性位点（如带有酚羟基的氨基酸）捕捉了自由基或与之产生氧化还原反应，或茶多糖大分子将自由基包埋起来使其无法进行氧化反应。

同时，由于茶多糖结构中存在大量的羟基和羧基，对过渡金属离子具有较强的络合作用，终止了自由基的链式反应，从而对自由基显示出较强的清除作用。另外，一般认为，高级结构呈螺旋状的多糖活性较高，而呈可拉伸带状或皱纹型带状的多糖活性一般较低甚至没有活性，三股螺旋构型是多糖最具活性的空间构象，而有报道发现茶多糖在水溶液中以有序的螺旋构象存在，这是否是茶多糖具有抗氧化活性的结构基础，有待进一步深人研究。

3结论

1）用微波辅助提取铁观音茶多糖，通过四因素三水平正交实验对微波处理条件进行优化，结果表明，影响得率的因素主次顺序是：微波功率>料液比>微波时间>水浴浸提温度；确定最佳的提取工艺条件为：微波功率375W，微波时间180S，水浴浸提温度60℃，料液比1：30。

2）抗氧化活性结果表明，铁观音茶多糖对O2ˉ·和·OH有较好的清除效果，其清除能力与多糖质量浓度有明显的量效关系，实验范围内的微波处理对其抗氧化活性无显着影响（P>0.05）。

3）与传统多糖提取技术相比，微波辅助提取技术可以大大缩短提取时间，具有节能、提取效率高等优点，并且，适量的微波处理对茶多糖的抗氧化活性并无明显影响。