微流控芯片对丹参滴注液中丹参素和原儿茶醛的测定

丹参滴注液是中药丹参单味药制剂，为淡黄色澄明液体，具有活血化瘀、通脉养心、活血消肿、养血安神等功效，临床上用于治疗冠心病、心绞痛、胸中憋闷等疾病。其活性成分可分为脂溶性和水溶性两大类，其中的水溶性有效成分主要为丹参素与原儿茶醛。丹参素和原儿茶醛的分子结构如图1所示。目前，这两者的测定方法主要有分光光度法、薄层扫描法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、电化学法和毛细管电色谱法J。而微流控芯片法分离测定丹参滴注液中的丹参素与原儿茶醛尚未见报道。本文采用微流控芯片非接触电导检测方法测定丹参滴注液中丹参素与原儿茶醛的含量，与现有方法相比，该方法具有样品前处理简单、分离快速、操作简便，试剂用量少等优点，为丹参滴注液中有效成分的分离测定提供了一种比较方便准确的新方法。

图1丹参素和原儿茶醛的分子结构

1实验部分

1.1仪器与试剂

微型压电陶瓷高压电源mj、非接触电导检测器和芯片l1¨均为自行研制，结构和原理如文献[10-11]报道。真空泵；数据工作站（本课题组编制）；PCL一711B型A／D卡（台湾EVOC出品）；数据记录与处理在普通P4微机上完成。2.（N一吗啉代）乙磺酸（MES）购自香港Amres公司；三（羟甲基）氨基甲烷（Tris），Fai?caChemicalSupplies，优级纯；其它试剂为国产分析纯。所有溶液用二次蒸馏水配制，在使用前用0.22m微滤膜过滤。对照品购自中国药品生物制品检定所，丹参素批号10855-200405，原儿茶醛批号110810-200506；丹参滴注液，上海华源长富药业有限公司，批号07030202。

1.2对照品与供试品溶液的制备

称取原儿茶醛对照品0.0200g，用二次蒸馏水溶解并定容于10mL量瓶中，得2.00g／L原儿茶醛对照品溶液，4℃下保存，临用时稀释成各浓度的标准溶液。用同样方法配制2.00g／L丹参素对照品溶液。丹参滴注液，用水稀释至适当的浓度范围，作为待测液。

1.3实验方法

新芯片使用前依次用乙醇、0.1mol／LHNO、0.1mol／LNaOH、H，O清洗10、10、60、30min。每次实验前分别用0.1mol／LNaOH、H，O及缓冲溶液清洗l0、10、15min。进样电压在100～500V范围选择，分离电压在500～5000V范围选择。每次实验完毕后用缓冲溶液冲洗5arin，以确保较好的重复性。每天实验完毕用二次蒸馏水将通道充满。检测器的激发电压60V（一）、激发频率60kHz。检测器的输出信号经A／D卡转换。实验在恒温（25℃）、恒湿（60％）条件下进行。

2结果与讨论

2.1条件优化选择

2.1.1缓冲溶液的选择实验考察了H3PO4一NaH2PO4、Na2HPO4一NaH2PO4、Na2HPO4一Na3PO4、柠檬酸一柠檬酸钠、Tris-HCI、HAc-NaAc、硼砂、乙二胺一HBO、三乙胺一HBO、二乙胺一HP0、三乙胺一HPO、MES-His、Tris-H，BO等几种缓冲体系在不同浓度、不同配比条件下对原儿茶醛、丹参素分离检测的影响。

结果发现：在除Tris-HBO外的上述缓冲体系中，基线稳定但不出现样品峰；而在Tris-HBO缓冲体系中，电泳电流小、峰形较好、基线平稳、噪音低、分离时间较短，是较理想的缓冲体系，有利于实验条件的优化。在此基础上，实验分别考察了Tris（10～30mmol／L）和HBO（10～30mmol／L）不同浓度配比的缓冲体系对分离检测的影响。发现随着缓冲液浓度的增加，体系分离度变大，丹参素、原儿茶醛的峰高增加，但迁移时间延长。且随着离子浓度加大，电流增大，焦耳热效应使基线噪音随之增加，影响分离效果；当缓冲液的浓度过低时缓冲能力降低，响应差，不利于定量检测。综合考虑分离和检测效果，选择20mmol／LTris一20mmol／LHBO，（pH=7.0）缓冲体系为分离介质。

2.1.2添加剂影响实验考察了甲醇、乙醇、环糊精（β一CD）、乙腈、十二烷基磺酸钠（SDS）等几种添加剂不同添加量对分离和检测的影响。结果发现分别加入体积分数为5％～10％的乙醇、甲醇或乙腈时，峰形变好，样品分离良好，基线噪音降低，但是重复性差。而在加入0.5～5mmol／L-CD时，峰形无明显改善，拖尾现象严重。加入SDS，峰形改善，样品分离较好，重复性也好。在0.5～1.5mmol／ISDS范围，随着SDS量的增加，峰形变好，但在2mmol／L以后，随着SDS量的增加，峰形变差，基线噪音开始加大。综合分离检测效果，选择优化的缓冲液浓度20mmol／LTris一20mmol／L硼酸一1.5mmol／LSDS（pH=7.0）作为电泳介质。

2.1.3分离电压实验考察了分离电压（0.5～3.0kV）对分离和检测的影响。发现电压低于1.5kV时，样品分离时间延长，分离效果不好，峰形差。随着分离电压的升高，样品分离时间缩短，分离效果改善，但分离电压高于2.6kV时，样品分离效果变差。可能是此时电流太大引起的焦耳热所致。综合考虑分离和检测效果，选择分离电压为2.5kV。上述优化条件下的电泳图谱如图2。

图2丹参素与原儿茶醛的芯片毛细管电泳图

2.2线性关系与检出限

精密量取丹参素和原儿茶醛对照品的储备液，配制成1～1.0×10mg／L的系列标准溶液，在优化条件下测定。在10～500mg／L范围内，丹参素的峰高（Y）与质量浓度（X，mg／L）呈良好的线性关系，线陛方程为Y=一13.2+0.762X，相关系数r=0.986，检出限为5.0mg／L（S／N=3）。在50～500mg／L范围内，原儿茶醛的峰高（1，）与质量浓度（X，mg／L）呈良好的线性关系，线性方程为Y=10.9+0.215X，相关系数r=0.993，检出限为10mg／L（S／N=3）。

2.3精密度实验

在优化的实验条件下，精密量取丹参滴注液，重复进样6次，测得丹参素峰面积的RSD值为2.1％、原儿茶醛峰面积的RSD值为2.8％，表明该方法的重复性比较好。

2.4样品分析与回收率

在优化的实验条件下，取丹参滴注液稀释10倍后进样3次测定。根据线性方程计算出丹参素的质量浓度为1.4×10mg／L，原儿茶醛的质量浓度为2.7×10mg／L。用标准加入法将丹参素、原儿茶醛的对照品按低（50mg／L）、中（100mg／L）、高（150mg／L）3种不同水平分别加入，测定其加样回收率，丹参素和原儿茶醛的平均回收率分别为99％和98％，平均RSD为2.5％（n=6）和3.1％（n=6）。

3结论

原儿茶醛和丹参素均含羧基，在中性至碱性的pH范围内带负电荷，可对电导检测器响应。本实验应用微流控芯片非接触电导检测装置在优化实验条件下3min内实现了对丹参滴注液中主要有效成分原儿茶醛和丹参素的分离和检测。非接触电导检测器操作比较简便，检测电极不与溶液接触，也不存在电极中毒的问题。此法操作简便、易行、灵敏度高，结果准确可靠，可用于丹参滴注液中有效成分的分离测定。