NAC类转录因子CsNAC7正向调控茶树咖啡因生物合成相关基因yhNMT1

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华南农业大学近日在《Horticulture Research》发表了名为《NAC类转录因子CsNAC7正向调控茶树咖啡因生物合成相关基因yhNMT1》的文章，通过对茶树愈伤组织的遗传转化，揭示了CsNAC7转录因子对咖啡碱的生物合成酶基因yhNMT1的正向调控作用，并促进咖啡因在茶树中的积累。

引言

茶含有丰富的功能代谢物，在全球范围内消费量很高。生物碱主要由咖啡因、可可碱和茶碱组成。咖啡因是茶叶生物碱的主要成分，占茶叶干重的2%-4%，已被证实具有许多有益作用，如提神醒脑、降低高血压和减轻焦虑。咖啡因其独特的生理活性而受到越来越多的关注，其生物合成机制的也得到了深入的研究。对不同咖啡因含量的茶叶品种的转录组分析表明，NACs与嘌呤生物碱的生物合成有关。然而，还没有研究揭示茶树中咖啡因的合成是如何受转录因子调控的。

方法

1.诱导愈伤：

用75%(V/V)乙醇浸泡10s，用1%(V/V)升汞消毒10min，然后用无菌水清洗3次。然后，将叶片切成0.5 cm×0.5 cm，培养在MS添加2.0mg/L6-BA,0.2mg/L IBA，30g/L蔗糖和0.8%(w/v)琼脂的固体培养基上，在25±2℃下培养12h/12h(1200lux，光/暗)，诱导愈伤组织。然后，将诱导的愈伤组织接种在含有0.2mg/L2,4-D，30g/L蔗糖和0.8%(w/v)琼脂的MS固体培养基上，并分成两组。

2.侵染：

将重组载体pCAMBIA1031-35SN-CsNAC7和RNAi-CsNAC7转化根癌农杆菌EHA105。选择经聚合酶链式反应鉴定的菌落，接种于含有50mg/L卡那霉素和20mg/L利福平抗生素的LB液体培养基中，在28℃下培养12h，以5000rpm离心2min收集农杆菌，再用MS培养基悬浮至OD600值0.6制成侵染液。将诱导出的茶愈伤组织切成约0.5 cm×0.5 cm的小块，在农杆菌侵染液+100μM乙酰丁香酮(AS)中浸泡20min。将侵染的愈伤组织在无菌滤纸上干燥，在MS固体培养基+100mol/L AS黑暗中培养3d。然后，用400mg/L羧基青霉素溶液清洗3次，用无菌水清洗3次，然后接种在MS固体培养基羧苄青霉素200mg/L和潮霉素(35mg/L)上；培养基每3周更换一次。大约60天后，获得了新的潮霉素抗性愈伤组织。然后对新再生的愈伤组织进行PCR和测序分析，以鉴定转基因愈伤组织。

3.茶愈伤组织中咖啡因含量的测定：

将茶愈伤组织切成小颗粒，在50℃烘干至恒重。准确称取0.5000 g的愈伤组织标本，加入20 m L开水40 min。萃取物立即过滤，自然冷却，然后加入总体积为25mL的ddH2O中。含量测定采用安捷伦1200系列高效液相色谱仪。色谱柱为Poroshell120Bonon-RP柱(4.6 mm×50 mm，2.7μm)，柱温30℃，流动相为(A)100%乙腈和(B)水+0.05%三氟乙酸。洗脱条件为：0∼8min，A为0%~9%，B为100%~91%，8∼为17min，A为9%~17%，B为91%~83%，17∼为26min，A为17%~28%，B为83%~72%。流速为0.8mL·μ-1，进样量为5 min L，根据标准品的保留时间确定咖啡因的峰浓度。

结果

酵母单杂法构建yhNMT1基因文库及候选转录因子

为揭示茶树咖啡因合成酶基因yhNMT1在茶树中的表达，构建了茶树咖啡因合成酶基因yhNMT1的cDNA文库，并用酵母单杂方法对其进行筛选。此外，为了通过筛选构建的cDNA文库来鉴定转录因子，利用诱饵载体Pnmt1-AbAi进行了AbA对新的寄主酵母菌株生长抑制的最低浓度的实验。

从cDNA文库中筛选出Tf编码基因CsNAC7的序列分析

筛选 SD/−Leu plus AbA中生长的菌落，测序。结果表明，整合到pGADT7载体中的基因具有完整的开放阅读框(ORF)，全长1371个核苷酸，编码456个氨基酸，相对分子质量为49.77 kD。该基因与茶树(Camellia Sinensis)含NAC结构域的类蛋白7亚型X2有99.12%的同源性，命名为CsNAC7。

CsNAC7在YEAST AH109中作为转录激活因子

为了确定CsNAC7基因是否具有自激活活性以及该基因的哪个区域具有激活作用，在酵母AH109细胞中进行检测。结果表明，所有菌株均能在SD/−Trp培养基中生长，但只有两株菌株能在SD/−Trp-His-Ade培养基中生长，且加入X-a-Gal后菌落颜色变为蓝色。我们的数据证实了CsNAC7基因N端具有自激活活性。

CsNAC7在烟草中的瞬时表达揭示了其转录因子功能

为了探讨CsNAC7对yhNMT1是否具有调控作用，构建了报告载体pNMT1-GUS和效应载体pCaMV35S-CsNAC7，然后将构建的两个载体和阳性对照载体pCAMBIA1301(pCaMV35S-GUS)转化农杆菌EHA105，并将其注入烟草叶片(图4A)。阳性对照中GUS活性最高，并且报告载体(PNMT1-GUS)和效应子构建体(pCaMV35S-CsNAC7)共转化的叶片GUS活性显著高于单独报告载体(图4B-C)

CsNAC7的亚细胞定位

为了确定转录因子CsNAC7的亚细胞定位，选择载体pGreen-C18-GFP(35S：GFP)，制备重组载体35S：CsNAC7-GFP(图5A)。在35S：CsNAC7-GFP转基因叶片中仅在细胞核中观察到GFP荧光，这表明CsNAC7蛋白定位于烟草的细胞核中。

CsNAC7和yhNMT1在茶树新梢中的表达分析

采集了不同季节(春、夏、秋)茶树新梢的不同部位(包括芽、第一叶和第二叶)(图6A)，用qRT-PCR方法检测了CsNAC7和yhNMT1的表达(图6B)。结果表明，CsNAC7和yhNMT1在春夏两季茶树枝条不同部位的表达变化规律相似。但在秋季，CsNAC7和yhNMT1的表达模式不同。

转录因子CsNAC7正向调控yhNMT1基因，促进咖啡因在愈伤组织中的积累

为了进一步阐明Tf CsNAC7对茶树yhNMT1表达和咖啡因积累的影响，将CsNAC7基因分别插入到pCAMBIA1031-35SN和pYLRNAi-35S中，构建了CsNAC7过表达和沉默的重组载体。通过农杆菌侵染茶树愈伤组织进行遗传转化，其中包括利用新产生的潮霉素抗性愈伤组织(图7A-D)。从抗性愈伤组织中提取基因组DNA，以此为模板进行HPT基因的扩增，结果表明转基因成功。CsNAC7基因在P7-1转基因愈伤组织中的表达是非转基因对照的6倍，咖啡因合成酶基因yhNMT1的表达水平是对照的2.46倍，说明CsNAC7基因在P7-1转基因愈伤组织中的过表达提高了yhNMT1基因的表达。与对照相比，CsNAC7和yhNMT1在R7-1中的表达分别降低了60%和46%，表明CsNAC7在转基因愈伤组织中的沉默降低了yhNMT1的表达。此外，用高效液相色谱法测定了咖啡因在愈伤组织中的积累(补充图)，P7-1中的咖啡因含量增加到1398μg/g，然而，R7-1中的咖啡因含量下降到358μg/g，下降了67%(图7F)。

总结

该研究的研究思路及愈伤转化体系值得我们参考。该研究以英红9号茶树为材料，以yhNMT1启动子为诱饵，确定了转录因子CsNAC7。为研究CsNAC7在茶树咖啡因积累中的作用，采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测CsNAC7和yhNMT1在茶树中的时空表达，并利用瞬时表达和酵母杂交技术分析CsNAC7的转录活性。此外，CsNAC7在茶树愈伤组织中过表达和沉默，并检测了转基因愈伤组织中yhNMT1表达和咖啡因含量的变化。

编辑：王胜楠

审核：杜兵帅